domingo, 8 de septiembre de 2019

Silenciamiento genético mediante micro ARNs


El silenciamiento de los genes está asociado a los RNA de doble cadena. En todos los casos de silenciamiento se acumulan pequeños RNAs de 21 a 24 nucleótidos. Estas moléculas provienen de RNAs de doble cadena que se degradan.

Genes y biologia

A raíz de una serie de estudios que demostraban la existencia de pequeños RNA de 21-24 nt en casos de genes silenciados nació el concepto de silenciamiento génico, un control de la expresión génica mediado por RNA no codificante. Esto desarrolló un nuevo campo de la biotecnología, el silenciamiento por RNA interferente (iRNA). Este silenciamiento génico funciona a dos niveles, tanto transcripcional como post-transcripcional, lo que nos da muchas posibilidades.

- Silenciamiento transcripcional por micro ARNs


Se trata de un mecanismo de metilación del DNA mediado por RNA. En plantas, la RNA Polimerasa II se une al promotor para transcribir el gen. En regiones promotoras ligeramente metiladas se une una polimerasa diferente, la Pol IV, que transcribe únicamente el promotor. Una vez transcrito llegan unas enzimas RDR2 (RNA polimerasa dependiente de RNA) que forman RNAbc (bicatenario) a partir del producto de la Pol IV.

Aquí llegan unas enzimas dicer (DCL3 en plantas) que cortan este RNAbc en pequeños RNA de 24 nt. Estos sRNA se unen a enzimas argonautas (AGO4 y AGO6) ubicadas en complejos proteicos. A estas enzimas argonautas puede unirse directamente el transcrito de Pol IV, que posteriormente se degrada por 3’-5’ endonucleasas hasta los 60 nt.

Luego llega Pol V, que vuelve a leer el promotor (al igual que Pol IV). Ahora, los complejos AGO4 y AGO6, unidos a los sRNA, se unen al transcrito de Pol V mediante complementariedad de bases. Una vez unidos atraen metiltransferasas, que metilan las zonas del DNA complementarias al complejo argonauta. De esta manera, el promotor pasa a estar completamente metilado. En la mitosis, esta metilación se mantiene por CMT3 y MET1.


- Regulación post-transcripcional por micro ARNs


La maduración del RNA implica la adición de una caperuza (CAP), una cola de poliA y la eliminación de intrones (explising). Cuando un gen se expresa demasiado, la maquinaria de maduración puede fallar, dando lugar a RNA aberrante, el cual se transforma en bicatenario por las enzimas RDR, es cortado por una enzima dicer en fragmentos de 21 o 22 nt y estos fragmentos se unen a las enzimas argonautas (AGO1).

Ahora, estos RNA unidos a AGO1 buscan entre el RNA de la célula aquellas secuencias complementarias para unirse a ellas. Estos complejos argonautas tienen actividad nucleolítica, lo que permite la degradación de los RNAm y regula la expresión del gen.

En las plantas, además, existe un mecanismo que solo elimina a los aberrantes. Se trata de un mecanismo alternativo al silenciamiento, y aunque ambos se completan entre sí, este se da antes. Se trata de un mecanismo activado por proteínas Upf.

El componente más importante del silenciamiento genético es el RNA bicatenario. Estos RNAbc se pueden obtener de varias fuentes:

. Duplicación invertida de genes que son casi totalmente complementarios y que, tras la transcripción, generan un ARN que es capaz de generar una horquilla y que luego es procesado por la enzima dicer.

. Un locus que contiene promotores opuestos y que, tras la expresión de ambos, dan lugar a dos ARN complementarios capaces de unirse y actuar de sustrato para la enzima dicer, generando pequeños ARN.

. Otros mecanismos como el gen TAS en Arabidopsis, donde se transcribe un ARN monocanetario al cual se le pueden unir directamente las enzimas argonautas y que desencadena una serie de procesos que dan lugar a ARN bicatenario que puede ser diferido por la enzima dicer.


- Tipos de small ARN


Un único RNA de cadena sencilla, mediante plegamiento, puede generar un RNA bicatenario. Por ejemplo, los microRNA se obtienen de sRNA con estructura de horquilla.

Los sRNA pueden medir de 21 a 25 nucleótidos, y se caracterizan por su origen y síntesis. La estructura bioquímica de un sRNA depende de si procede de un dicer o de un RDR. Siempre se unen a su diana por complementariedad de bases, y han sido descritos en todos los eucariotas, aunque también se encuentran en bacterias (con características diferentes).

Los sRNA, a nivel transcripcional, pueden cortar los RNAm o impedir la traducción del mismo. Mientras que el corte del RNAm se da más en plantas, el impedimento de la traducción se da más en animales. También son capaces de reprimir, a través de la modificación de histonas, la expresión de un gen. Los dos tipos más importantes son los microRNA (miRNA) de aproximadamente 21 nt y los RNA interferentes (siRNA). Existen otros tipos, como los PIWI o los Small modulatory RNA.

La producción de sRNA es síntoma de silenciamiento. Se pueden encontrar sRNA a lo largo de todo el genoma (genes, regiones intergénicas, transposones, etc). Existen herramientas para detectar, clonar y secuenciar los sRNA, lo que permite conocer qué genes silencian.

+ Proteínas importantes en la formación de ARNs pequeños


. RDR. Enzimas capaces de pasar de RNAmc a RNAbc. Se encuentran en todos los eucariotas excepto mamíferos y moscas. Esto es así porque los mamíferos poseen enzimas capaces de usar DNA y RNA.

. Dicer. Se encuentran en todos los eucariotas. Dependiendo del organismo podemos encontrar de un único dicer a varios (de 4 a 6 en plantas). Tienen dominios RNAsa 3 únicos que reconocen RNAbc. Dependiendo el tamaño del sRNA, lo reconocerá un dicer determinado. Esto depende del dominio PAZ del dicer y sus dominios catalíticos. Así, un tipo de enzima dicer es capaz de cortar una única longitud (de 21 a 24 nt).

El hecho de que existan diferentes enzimas dicer en un mismo organismo implica una especialización en el proceso. Dependiendo de cómo se forme el RNAbc, se unirá una enzima dicer determinada. Aunque en ocasiones se complementan si una falla, aunque el nuevo sRNA será diferente al que debería ser y regulará de forma diferente.

. Enzimas argonautas. Las enzimas argonautas, dependiendo del tipo, actuarán a distintos niveles. Se encuentran en todos los organismos, lo que implica que están muy conservadas. Estas enzimas tienen muchas más variaciones (de 1 a 27 según la especie). Cada enzima argonauta tiene un sRNA asociado y una función determinada.

Los argonautas son específicos de un tipo de sRNA. Esto se debe a una serie de criterios, como la estabilidad termodinámica de la cadena, de la identidad de la cadena 5’ y/o del tamaño del RNA. Esto determinará que cadena se une a la enzima y cual se degrada. En animales, el factor más importante es la estabilidad (la cadena menos estable es la que se une a la enzima).

- Metilación del ADN dirigida por ARN


La RNA polimerasa II puede dar lugar a RNA aberrantes no solo por falta de cap, poli A o similares, sino también porque comienza a leer el gen un poco antes, lo que forma un RNA aberrante que luego se transforma en RNAbc por una enzima RDR (en plantas) y es reconocido por una enzima dicer que forma un montón de sRNA.

Los complejos enzimáticos argonautas que se forman a través de estos sRNA reconocen la zona que no debería haberse transcrito y atraen a las metiltransferasas, lo que metila parcialmente el gen. De esta manera, se atrae a Pol IV y Pol V, lo que desencadena el mecanismo de silenciamiento antes mencionado.

La gran mayoría de las dianas del silenciamiento genético son los transposones, ya que son muy peligrosos por su capacidad de salto en el ADN.

+ Estrategias de silenciamiento


Los miRNA tienen identidad génica, es decir, están producidos directamente por un gen que no produce proteína, sino miRNA. El RNAm procedente de este gen sufre varios procesamientos.

En animales, el corte por el dicer se da en el citoplasma, mientras que en las plantas se produce en el núcleo. A veces, estas zonas que se pliegan se encuentran en los intrones. Así, estos genes pueden generar una proteína y una miRNA a la vez (aprovechamiento del gen). De esta manera, el miRNA que procede de un gen siempre es el mismo. Tienen también un sistema de regulamiento en trans, ya que regulan un gen diferente del que los codifica.

Por el contrario, los siRNA son diferentes, ya que proceden de RNAbc diferentes entre sí, ya que además de poder formarse un RNA aberrante diferente cada vez, puede ser cortado de diferentes maneras dependiendo de las enzimas que se le unan. Se obtiene entonces una población de siRNA.

En plantas, el apareamiento de los miRNA es total, mientras que en animales no es necesario y es posible que existan zonas desapareadas. Aunque es necesario que exista una zona especial, la secuencia semilla, que necesita de un apareamiento completo.

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Artículo redactado por Pablo Rodríguez Ortíz, Graduado en Biología por la Universidad de Málaga.