viernes, 2 de agosto de 2019

Recombinación e ingeniería genética


La ingeniería genética es un conjunto de técnicas moleculares dirigidas a localizar, aislar, alterar y analizar segmentos del DNA. El término recombinante se refiere, en este contexto, a la combinación de fragmentos de DNA de diferentes fuentes (organismos, especies o individuos).

Recombinacion, ingenieria genetica y biologia

La clonación, en el sentido molecular, implica aislar una secuencia de DNA de interés, insertarla en una molécula vector (vector de clonación) con capacidad replicativa, e introducir dicha construcción en un organismo de experimentación unicelular (típicamente bacterias), que al multiplicarse generará múltiples copias idénticas de la secuencia de interés (un clon de DNA).

Cuando refiere a organismos, la clonación consiste en la generación de una serie de organismos genéticamente idénticos a un determinado organismo original, sea este unicelular o multicelular.

En organismos unicelulares, un clon es un grupo de células genéticamente idénticas derivadas por división asexual a partir de un ancestro común. Por ejemplo, una colonia bacteriana, formada por múltiples copias genéticamente idénticas de la bacteria original de la que se originaron por división celular, constituye un clon bacteriano.

- Vectores plasmídicos


Un plásmido es una molécula de ADN extracromosómico (episoma) que, coexistiendo con el cromosoma, es capaz de replicarse, controlar su número y mantenerse de forma estable en una población de hospedadores bacterianos.

Que los plásmidos coexistan con el cromosoma como moléculas autónomas no significa que sean independientes del hospedador. La maquinaria de replicación del hospedador es necesaria pero no suficiente para la replicación del plásmido. Existe un rango de hospedador, es decir, hospedadores donde ese plásmido es capaz de replicarse.

Los plásmidos tienen una serie de zonas determinadas que son necesarias:

. Replicón. Se trata de un origen de replicación (u ORI). Hace a la molécula replicativa.

. Marcador seleccionable. Es un gen que permite la selección directa del individuo transformado.

. Multi-cloning site (MSC). Zona que acumula dianas de enzimas de restricción.

El proceso de clonación necesita de una serie de enzimas capaces de llevar a cabo las reacciones necesarias. Por ello, se necesitan polimerasas, nucleasas, ligasas y enzimas modificadoras (añaden o eliminan sustituyentes químicos a los nucleótidos).

Para la extracción del DNA plasmídico se utilizan las minipreps, preparaciones que permiten extraer este DNA plasmídico de forma sencilla. Primero se lisa la célula con un detergente y se desnaturaliza el DNA de la célula (plásmido y cromosómico). Luego se vuelve a pH neutro, lo que hace que precipiten lípidos y proteínas grandes. Los plásmidos renaturalizan fácilmente y quedan suspendidos, mientras que el DNA cromosómico renaturaliza parcialmente y se queda atrapado en el precipitado. Por último, una centrifugación permite separar el DNA plasmídico del precipitado.

- Enzimas de restricción


El origen de las enzimas de restricción se encuentra en los sistemas bacterianos de modificación-restricción, que actúan como barrera frente al DNA foráneo (normalmente de origen viral). Las endonucleasas realizan cortes en las dos cadenas del DNA, reconociendo una secuencia de nucleótidos específica y normalmente palindrómicas. Las nucleasas más utilizadas en ingeniería genética son las endonucleasas de tipo II, capaces de cortar en la zona que reconocen.

Existen centenares o miles de enzimas de restricción aisladas y purificadas de diversas bacterias para su uso in vitro. Cada enzima posee ciertas características operacionales que deben ser conocidas para un uso correcto.

Lo general es usar enzimas que posean una diana de tamaño medio (número de nt) ya que, a menor longitud de la diana, mayor es la probabilidad de que existan más dianas exactamente iguales a lo largo del genoma, lo que aumenta la probabilidad de cortes off target.

Una de las cosas a tener en cuenta a la hora de elegir la enzima a utilizar es que no genere corte en el fragmento a clonar ni afecte a las funciones principales del vector (ORI o marcador selecicionable). Para esto se mira en el MCS del vector, donde se encuentran las secuencias de corte único en el plásmido. Existen webs que te permiten obtener el listado de sitios de restricción AUSENTES en el fragmento de DNA a clonar.

En los extremos de los primers se pueden incluir secuencias de nucleótidos reconocidas por enzimas de restricción específicas que cumplan todos los requisitos para nuestra clonación. Cuando usamos una única enzima de restricción existe la posibilidad de que el plásmido se autoligue en vez de unirse a nuestro fragmento de DNA. Además, también es posible que el fragmento se una “del revés” y no pueda expresarse.

Si utilizamos dos enzimas diferentes, cada extremo genera un extremo diferente y obtenemos una clonación dirigida. Esto, además, impide que el vector pueda religar. Puede hacerse generando dos extremos cohesivos incompatibles o mediante una combinación de romo-cohesivo.

Cuando el fragmento o el plásmido tiene un lugar diana de la enzima a utilizar, lo que nos impide su uso, podemos tener en cuenta que existen enzimas diferentes con extremos compatibles. De esta manera, se puede utilizar una enzima para generar corte en el vector y otra enzima diferente para el fragmento, aunque volveríamos al problema de que el vector puede autoligarse o el fragmento entrar “del revés”. Además, al ligarse, la zona nueva no es compatible con ninguna de las dos enzimas originales utilizadas, por lo que habría que buscar una tercera para generar un corte ahí.


- Características operacionales de las enzimas de restricción


Las enzimas de corte requieren de unas características operacionales para incrementar su eficiencia. Algunas de estas características operacionales son los componentes de la reacción y sus proporciones, el tampón de restricción (tipo y concentración), la temperatura óptima de funcionamiento, el volumen total de enzima y el número de unidades, y si presenta actividad star (alteración de la especificidad de la enzima) o es inactivable por calor.

El tiempo de incubación debe ser lo más exacto posible teniendo en cuenta las condiciones anteriores, ya que si lo aumentamos puede generar cortes off target o, si lo disminuimos, es posible que no se hayan generado tantos cortes como necesitamos.

Algunas enzimas no son capaces de cortar con la misma eficacia cuando sus dianas se encuentran cerca de los extremos de un DNA lineal, ya que por volumen de la enzima es posible que no se puedan unir de forma estable al DNA y no puedan generar el corte. Cuando se diseñan los primers de PCR es conveniente añadir bases extras, que deben elegirse de forma que no formen palíndromos ni se puedan formar dímeros con los oligos usados para la amplificación.

- Polimerasas termoestables para PCR


Las enzimas que se utilicen para hacer la PCR necesitan ser termoestables, es decir, que sean funcionales a la temperatura en la que el DNA se encuentra desnaturalizado. Las dos polimerasas principales utilizadas en PCR son Taq y Pfu.

Los productos de PCR obtenidos a partir de Taq pueden clonarse muy eficientemente en vectores con extremos 3’ con timinas adicionales. Aunque esto implica la necesidad de utilizar una ligasa T4, nos evita tener que incorporar secuencias diana en los cebadores. Para esta enzima existen unos plásmidos determinados, los pGEM-T, que poseen en el MCS timinas adicionales para unir los fragmentos clonados con Taq.

- Selección y comprobación de clones recombinantes


La clonación in vitro es un proceso ineficiente. Hay que tener en cuenta que la mezcla de ligación incluye una minoría de plásmidos recombinantes (con inserto) frente a una mayoría de vectores vacíos (religados o que nunca se llegaron a cortar). Hay que probar varias proporciones de vector: inserto e incluir controles (solo vector o solo inserto).

Hay también que preparar las células, es decir, colocar las células en condiciones concretas para que adquieran de forma más sencilla el DNA. Esto se puede hacer teniendo en cuenta la temperatura de crecimiento, la intensidad de agitación a la que se somete, el grado de aireación, la densidad celular, etc.

Como la transformación es un proceso ineficiente, es necesario seleccionar aquellas bacterias en minoría que han adquirido el plásmido y librarnos de aquellas que no lo han obtenido, que son mayoría.

Este proceso se hace principalmente sembrando en antibiótico. La resistencia a un antibiótico es un carácter cuantitativo, no cualitativo, por lo que es necesario también determinar la cantidad mínima inhibitoria (cantidad mínima de antibiótico necesaria para eliminar a los no transformantes).

Ahora sería necesario hacer un escrutinio de las células transformadas, para ver cuáles de ellas tienen el vector vacío y cuáles de ellas el vector recombinante. Una vez que se han obtenido las poblaciones se analizan los patrones de bandas de digestión que presentan, lo que nos permite determinar, entre otras cosas, la dirección de inserción del fragmento. Se puede hacer mediante restricción o mediante PCR.

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Artículo redactado por Pablo Rodríguez Ortíz, Graduado en Biología por la Universidad de Málaga.