viernes, 5 de julio de 2019

Modificación al azar del genoma en bacterias


Las bacterias son uno de los organismos más utilizados a lo largo de la historia de la biología, permitiéndonos hacer importantes descubrimientos sobre procesos moleculares, metabólicos, genéticos, etc.

Genoma de bacteria y biologia

Estos descubrimientos y estudios se han podido llevar a cabo gracias a las técnicas de modificación genética que nos han dado la opción de diseñar bacterias con las características necesarias.

- Elementos transponibles y modificación al azar


Los elementos transponibles son elementos genéticos capaces de transportarse de un punto a otro de un replicón o entre dos replicones de forma independiente de la recombinación homóloga.

La transposasa, codificada en el propio transposón, escinde al elemento transponible de su localización y lo inserta en otro punto distinto. Estos elementos transponibles son muy variables en estructura y suelen estar limitados por secuencias repetidas, que actúan de diana específica de la transposasa. Además, pueden transportar otros genes que confieren diversos fenotipos.


+ Mecanismos de transposición


Cuando el mecanismo es de transposición conservativa, el transposón se relocaliza en la célula sin dejar copia, creando una molécula dañada o que se digiere por ser lineal, lo que genera problemas.

Cuando el mecanismo es de transposición replicativa, el transposón se relocaliza dejando una copia en el lugar. Durante la transposición se crea una molécula integrada que luego se escinde para dar dos moléculas. Suelen llevar una recombinasa que reconoce las zonas repetidas y genera una recombinación específica de sitio (SSR).

La reacción de la transposasa en realidad son dos reacciones, una escisión y una unión. Los transposones que realizan la transposición conservativa escinden en doble cadena, mientras que los que hacen transposición replicativa generan cortes de cadena sencilla que luego permiten la formación del cointegrado.

En la inserción, todos los transposones tienen una diana. La transposasa reconoce y se una a la diana, y genera dos cortes de cadena sencilla y se inserta. En el hueco que queda a ambos lados, la propia célula lo rellena. Esto permite reconoce la diana del transposón, ya que a ambos lados del mismo encontramos la misma secuencia.

- Mutagénesis con transposones


Los transposones son agentes mutagénicos, ya que pueden irrumpir en un gen y hacer que pierda su función, aunque a veces pueden mantenerse si se introduce al final de un gen y no afecta demasiado.

Muchos de estos elementos saltan al azar porque sus dianas son muy pequeñas en nucleótidos, o están muy degeneradas (poseen grandes grupos de dianas). Las que se usan en ingeniería genética tienen dianas muy generadas, lo que permiten que casi puedan unirse al azar a cualquier lugar del genoma. Esto permite su inserción en cualquier gen no esencial (ya que, si es esencial, la célula no crecería). Además, en ingeniería genética se suelen usar marcadores seleccionables que van siempre asociados al transposón.

Cuando un transposón se inserta en un operón, normalmente genera mutaciones que son polares sobre los genes distales. Si un transposón se inserta en uno de los genes (A), aborta la transcripción y no se crea mensajero, lo que impide que se expresen los genes B y C. (genotipo A-, B- y C-). Si se diese en B, por ejemplo, sería A+. B- y C-.

Los transposones naturales pueden saltar repetidas veces, y no tienen por qué quedarse donde primeramente se insertaron (transposición secundaria), y provocar mutaciones adicionales.


+ Minitransposones


Los minitransposones son derivados de los transposones, construidos artificialmente y que no llevan la transposasa en el elemento transponible. La transposasa es un elemento activo en trans, lo que permite que se pueda proporcionar desde fuera del elemento. Al no llevar transposasa, estos minitransposones no presentan transposición secundaria.

+ Transposomas


Los transposomas son preparaciones hechas in vitro de un transposón, con la transposasa unida covalentemente a sus extremos. Estos complejos se introducen en el hospedador a por electroporación y se transponen de forma muy eficaz.

Estos sistemas son especialmente útiles para organismos que no poseen sistemas genéticos o que no son capaces de expresar la transposasa.

Su funcionamiento se ha probado en más de 30 estirpes bacterianas Gram+ y Gram- así como en levaduras. Para seleccionar los mutantes deseados puede hacerse una selección directa (aunque no es lo más común) o por selección de inserciones (antibióticos o marcadores seleccionables) y luego mediante pruebas fenotípicas.

+ Transposición in vitro


Para muchos transposones, la reacción de transposición se puede reproducir in vitro en presencia de una transposasa purificada y el ADN diana. Puede usarse como alternativa para mutagenizar genomas completos usando ADN cromosómico como diana, o genes concretos clonados en un plásmido.

El material mutagenizado se reintroduce en el hospedador por electroporación para poder conocer cómo se ha insertado y, en caso de que sea posible, el análisis funcional de este material mutagenizado.

- Aplicaciones de los transposones


+ Fusiones génicas


Se introduce el gen reporter en el fragmento del transposón y se fusiona al gen cuya actividad se quiere medir, y como el promotor y la expresión no se modifica, podemos conocer la expresión y regulación del gen de interés.

Existen dos tipos de fusiones, la fusión transcripcional y la fusión traduccional. En la fusión transcripcional. En las fusiones traduccionales, el gen reporter está fusionado al gen de interés. La probabilidad de que se fusione dependerá de si es transcripcional o traduccional. Si es transcripcional se insertará en un 50% (el otro 50% es que entre del revés). Si es traduccional, el reporter tiene que caer en la fase de lectura, es decir, 1/3. Así, 1/2 x 1/3 = 1/6 de que se fusione correctamente.

Los ministransposones también pueden usarse para la generación de fusiones génicas. Estos minitransposones contienen un gen indicador sin promotor adyacente a uno de los extremos del transposón. Cuando se insertan en la orientación adecuada, por detrás de un promotor, se genera una fusión génica cuantificable por la actividad del indicador. Algunos ministransposones generan fusiones traduccionales (proteínas de fusión).


+ Expresión condicional de genes


Se puede insertar en la región promotora un transposón que lleve un promotor regulado, lo que te permite regular la expresión del gen de interés y observar su efecto, sobre todo en genes esenciales. Unos transposones que se usan para esto son los transposones TPOP, que poseen dos marcadores seleccionables y promotores en ambas direcciones.


+ Inserción específica de sitio


Tn7 es un transposón no compuesto que contiene genes de resistencia a trimetoprim (dhflr) y a estreptomicina (aadsAI). Tiene una transposasa compuesta producto de cinco genes (tnsA-E).

Posee una inserción específica en un sitio único attTn7 que se encuentra en numerosas bacterias Gram negativas. Este attTn7 se localiza inmediatamente detrás del gen glmS, y su inserción no causa ningún daño en la bacteria, ya que es una zona intergénica. Este transposón se usa para introducir genes sin causar daños en la bacteria. Tolera fragmentos muy grandes.


+ Inserciones en fase con ministransposones


Estos minitransposones poseen en sus extremos un reporter y un marcador de resistencia, y además unos cuantos sitios de recombinación específica de sitio o dianas de restricción. Así, se puede eliminar el fragmento central.

Ahora, al eliminarse el fragmento introducido, queda una pequeña inserción que está en fase y se conoce la secuencia. Si se usa un sitio de recombinación específica puede usarse, in vivo, una recombinasa que elimine la zona central. Esto se puede usar en estudios de estructura y función. La generación de una colección de inserciones en fase en el mismo gen permite determinar qué regiones son permisivas y cuáles no.

Con esto también puede realizarse una inactivación proteolítica in vivo. Así, se crean sistemas para inactivar una proteína rápidamente introduciendo en fase un fragmento que sea reconocido por una proteasa cuando se exprese la proteína pero que se encuentre en una zona permisiva. Así, la proteína es funcional y se expresa, y con solo añadir la permeasa determinada, se inactive esta proteína.

También puede usarse para activación por recombinación. Mientras que el transposón está, el gen está inactivo, mientras que si se elimina este el proceso es irreversible. Un sistema, por ejemplo, que exprese una recombinasa específica de sitio cuando aparece un contaminante, eliminaría el transposón y quedaría una marca (cicatriz genética) que nos indica que hubo contaminante en caso de que la exposición sea transitoria.

----------

Artículo redactado por Pablo Rodríguez Ortíz, Graduado en Biología por la Universidad de Málaga.