viernes, 21 de abril de 2017

Técnicas de diagnóstico de infección vírica



Los métodos de detección en cultivos celulares se basan en la infectividad vírica. La infectividad es la capacidad de un virus de multiplicarse en sus células hospedadoras, produciendo en las mismas cambios fenotípicos reconocibles (efectos citopáticos = CPE).

Infeccion virica y biologia

- Efectos citopáticos víricos


+ Efectos citopátidos más utilizados


Los virus producen un amplio número de efectos citopáticos en las células que hospedan, aunque los que se más usan para las técnicas de diagnóstico de infecciones víricas son aquellos que son más fáciles de ver a simple vista o través de microscopio. Algunos de estos efectos más utilizados son los siguientes:

. Alteración en la forma celular y pérdida de la capacidad de adhesión

El crecimiento del virus desestructura el citoesqueleto y la célula no puede adherirse al sustrato.

. Lisis celular

Los virus citocidas producen calvas de lisis, en más o menos tiempo. Esta lisis se puede deber a cambios de la permeabilidad de membranas, rotura de lisosomas o inducción de apoptosis.

. Formación de sincitios

Lo producen aquellos virus que sintetizan proteínas de fusión activas a pH fisiológico. Las células expresan las proteínas de fusión y se fusionan con las células vecinas. Se forma un policariocito.

. Vacuolización del citoplasma

Aparecen proliferaciones en membranas intracelulares en forma de vacuola.

. Aparición de cuerpos de inclusión

Pueden aparecer en el citoplasma o en el núcleo, y a veces en ambos. Se tiñen de forma sencilla y son los sitios donde se acumulan los componentes para la progenie o los propios viriones.

. Citomegalia

Hay células que, infectadas por ciertos virus, aumentan considerable su tamaño.

+ Otros efectos no citopáticos: hemadsorción y transformación celular


Otros efectos utilizados para dichas técnicas, aunque no son citopáticos porque no causan la muerte celular, son la hemadsorción y la transformación celular.

. Hemadsorción

La hemadsorción es la capacidad de las células de capturar a los eritrocitos debido a la expresión de hemaglutinina por parte del genoma viral.

. Transformación celular

La transformación celular se da cuando los virus son oncogénicos.

- Técnicas de diagnóstico serológicas


Dependiendo del tipo de infección y caso se puede usar técnicas serológicas o moleculares. Con las técnicas serológicas se buscan antígenos o proteínas del virus, mientras que en las moleculares se buscan partes concretas del genoma.

+ Neutralización de la infectividad vírica. Seroneutralización.


Esta técnica se usa en aislados del virus, y no se puede realizar sobre el organismo. Se utiliza un anticuerpo capaz de unirse a los antirreceptores del virus, neutralizando los mismos y evitando que se vean efectos citopáticos.

Se hace un ensayo cuantitativo, en una muestra se hace sin anticuerpo y en otro con el mismo, y se observa la disminución del número de CPE.

Este ensayo no solo sirve para identificar virus, sino que también sirve para titular el virus (una cantidad determinada de anticuerpo y diluciones de virus) y para titular anticuerpos (se usan anticuerpos policlonales). Si el virus es muy similar al utilizado para obtener el anticuerpo habrá mucha neutralización, mientras que, a menor similitud, menor neutralización.

Para titular anticuerpos se hacen diluciones del anticuerpo con una cantidad fija de virus y, tras un tiempo de neutralización, se hace un ensayo cuantitativo por diluciones al límite. Se llama título neutralizante.

+ Doble sándwich de anticuerpos


Se hace inmunocaptura con un anticuerpo unido a una fase sólida y posteriormente se añade otro anticuerpo que se una al antígeno, estando este último marcado de alguna forma para poder realizar posteriormente su observación.

+ Detección de anticuerpos antivíricos en suero


Se utiliza sobre un soporte sólido el antígeno viral y se le añade el suero de un animal que queremos ver si está o ha estado infectado, es decir, tiene anticuerpos para dicho antígeno. Posteriormente se le añade otro anticuerpo para el anticuerpo problema marcado para poder ser observado posteriormente.

+ Inmunofluorescencia indirecta (IFI)


Requiere la detección de los anticuerpos sometiendo la muestra a una determinada longitud de onda, para que el fluorocromo posteriormente emita luz visible. Se utiliza un anticuerpo que se una al antígeno, y a este se le une otro anticuerpo unido a un fluorocromo que permite localizar el antígeno.


+ Ensayo inmunoenzimático (ELISA)


En un recipiente con pocillos se añade la muestra, y este se recubre con anticuerpos de captura que se unen al antígeno diana, se deja incubar y posteriormente se lava para eliminar cualquier resto no deseado en la muestra.

Posteriormente se añade un segundo anticuerpo, este marcado de alguna forma, y se vuelve a incubar y lavar. Ahora se le añade un sustrato cromogénico que, en contacto con el anticuerpo marcado, virará en color y este podrá ser medido en un ELISA mediante una medición de absorción.

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- Qué es un virus | Vídeo



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Artículo redactado por Pablo Rodríguez Ortíz, estudiante de Biología en la Universidad de Málaga.