lunes, 19 de noviembre de 2012

Clonación del ADN



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El proceso de clonación de un gen consta de tres etapas, que veremos detenidamente en esta entrada. 

Clonacion de ADN en biologia molecular

- Elección del ADN que ha de clonarse


La primera requiere proceder a la elección del ADN que ha de clonarse: puede tratarse de ADN genómico extraído directamente de los cromosomas, o bien ADN copiado del ARN mensajero, que se llama ADN complementario (o ADN copia) y se escribe abreviadamente ADNc. El ADNc es sintetizado por una enzima particular, la transcriptasa inversa, que, al contrario de lo que sucede en la transcripción normal, usa como plantilla el ARN mensajero y transcribe una molécula idéntica de ADN.

- Preparación de los fragmentos de ADN que han de insertarse en vectores de clonación


La segunda etapa consiste en la preparación de los fragmentos de ADN que han de insertarse en vectores, que pueden estar, en consecuencia, constituidos por ADN genómico o por ADNc, y en la introducción de los vectores recombinantes en células bacterianas; éstas se hacen crecer y multiplicarse en cápsulas con un medio de cultivo adecuado, enriquecido con un antibiótico que impide el crecimiento de las células bacterianas sensibles a la acción de los antibióticos.

Cada célula bacteriana que se haya convertido en resistente al antibiótico puede, de esta manera, proliferar formando una colonia de células hijas todas ellas genéticamente idénticas; en consecuencia, esta colonia se compondrá de bacterias que han hospedado un vector con el mismo fragmento de ADN exógeno.

Cada cápsula contiene muchas colonias distintas de bacterias. Una cosecha de fragmentos de ADN exógeno distintos (por consiguiente, de colonias bacterianas diferentes) constituye una biblioteca genómica o genoteca. Una genoteca puede contener, en teoría, todo el ADN cromosómico fraccionado de un mamífero, o bien moléculas de ADNc obtenidas de todos los ARN mensajeros producidos por una determinada célula eucariota. Una genoteca es como una biblioteca carente de un índice que registre la posición de cada libro en particular, es decir, de los clones que contienen un fragmento determinado. Para identificar una colonia determinada que contenga la secuencia de ADN preseleccionada, es menester pasar a la tercera etapa, consistente en el cribado (screening) mediante una sonda de reconocimiento. Una sonda consiste en un segmento de ADN formado por una secuencia de bases complementarias del fragmento que ha de identificarse; es decir, una secuencia de ácidos nucleicos que se aparea con el fragmento dado. Para identificarla, la sonda ha de marcarse con fósforo radiactivo, 32P.

Supongamos que se desea clonar una porción de ADN donde se cree que está contenido un gen. Para empezar, la porción ha de subdividirse en fragmentos de dimensiones adecuadas para que puedan ser clonados en el vector previamente seleccionado, como por ejemplo el fago lambda. Los vectores fágicos, en los que están insertos los fragmentos que han de ser clonados, se empaquetan luego in vitro formando partículas fágicas, capaces de infectar las bacterias al introducir su ADN en las células hospedadoras. A continuación, las células bacterianas infectadas se "encapsulan", formando así una genoteca constituida por un número de placas fágicas que varía entre algunos miles y varios millones; cada una contiene un segmento distinto del ADN clonado.

Una vez encapsulada la genoteca, se obtiene una copia de ella depositando sobre la cápsula un filtro de nitrocelulosa; de esta manera, cada placa se transfiere al filtro, el cual se convierte en una copia exacta de la cápsula. Los filtros reciben luego un tratamiento especial para que el ADN de las placas se fije a la nitrocelulosa. En ese momento se procede al cribado, que se consigue incubando la copia de nitrocelulosa con una sonda de ácido nucleico. La sonda está constituida precisamente por una secuencia nucleótida, marcada con el fósforo radiactivo, que es complementaria de una porción del gen que se busca. La sonda radiactiva se unirá con las secuencias que encuentre en el filtro y que le sean complementarias; este proceso se denomina hibridación. Tras la hibridación, los filtros se lavan para eliminar la sonda que no se ha unido a ninguna secuencia, de manera que sólo queden aquellas moléculas de sonda firmemente unidas a las secuencias complementarias que presente el ADN fágico en el filtro de nitrocelulosa. La determinación de la sonda que se ha unido se consigue exponiendo los filtros sobre una placa sensible a los rayos X (autorradiografía), en la que aparecerán manchas oscuras allí donde la sustancia esté presente. De este modo, la posición de la sonda queda marcada por una mancha sobre la placa de exposición. Superponiendo esta última a la cápsula original, se podrán identificar las placas fágicas con secuencias complementaria y el clon que interesa encontrar.

Una vez aislado un fragmento de ADN genómico o de ADNc de una genoteca, se puede estudiar su posición precisa en el genoma de un organismo. Para ello se utiliza el método del Southern blotting, consistente en un proceso de "absorción" y que resulta muy eficiente para estudiar la estructura de los genes. Para llevar a cabo un Southern blotting, el ADN genómico se corta con enzimas de restricción; los fragmentos resultantes se separan de acuerdo con su longitud mediante electroforesis en un gel de agar. Se aplica sobre el gel un papel de filtro de nitrocelulosa, sobre el cual se transfieren y se fijan los fragmentos de ADN por absorción de una solución salina. De esta manera, se reproduce sobre el filtro de nitrocelulosa una copia exacta del ADN. El filtro se hibrida después con una sonda marcada que es específica para el gen en cuestión; la sonda solamente se hibridará con aquellos fragmentos de ADN genómico que le sean complementarios y la autorradiografía del filtro señalará su posición. A continuación, se podrá trazar un mapa físico del gen a partir de las dimensiones de los fragmentos, cribando las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción. Comparando esta muestra de ADN con otras se puede localizar diferencias en el tamaño y el número de los fragmentos, que permiten poner de manifiesto anomalías tales como deleciones o translocaciones del gen. Las anomalías de este tipo son, de hecho, la causa de muchas enfermedades genéticas.

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