La considerable longitud de las moléculas de ADN ha obligado a los biólogos a idear nuevas estrategias para su manipulación, colaborando así al rápido desarrollo de la biología molecular, disciplina ante la que hoy se abre un futuro muy prometedor. Las técnicas actuales del ADN recombinante permiten aislar un gen del genoma de una célula e introducirlo en otras donde pueda expresarse.
- La comprensión de la organización del ADN
Para comprender adecuadamente la organización del ADN es necesario descubrir la sucesión exacta de los nucleótidos que lo componen, análogamente a como es preciso leer las palabras de un libro si queremos conocer su contenido. Para ello es menester cortar el ADN en pequeños segmentos más manejables. Hacia los años setenta se conocían unas enzimas, llamadas desoxirribonucleasas, que cortaban el ADN de un modo no específico, es decir, sin una regla fija y al azar. Este tipo de enzimas, llamadas genéricamente nucleasas, digieren en efecto los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos en la cadena de ADN. Los cortes conseguidos con estas enzimas no eran de ninguna utilidad, ya que producían una gran diversidad de fragmentos para los que resultaba imposible establecer cuál era el orden en que estaban dispuestos en la molécula original de ADN de la que procedían. En este sentido, el descubrimiento de las enzimas de restricción supuso un gran adelanto.
- Las enzimas de restricción
Se constató que diversas cepas bacterianas poseían una serie de enzimas, llamadas endonucleasas de restricción, capaces de cortar el ADN por puntos determinados. Ello constituye un sistema de defensa de las bacterias contra la invasión de ADN ajeno que se produce durante una infección vírica. Además, con objeto de salvaguardar los puntos del ADN propio que son sensibles a la acción de las endonucleasas de restricción, las bacterias han desarrollado un sistema de protección constituido por otras enzimas, llamadas metilasas, que metilan (es decir, modifican químicamente) las bases susceptibles de verse afectadas por la acción de las endonucleasas de restricción y las hacen insensibles a ella. La primera enzima de este tipo se aisló en la bacteria Haemophilus influenzae, en la que el ADN vírico se degradaba rápidamente. Se descubrió que dicha enzima, llamada Hind II, cortaba la doble hélice de ADN solamente por una determinada secuencia de 6 bases:
(5') G T N ^ N A C (3')
(3') C A N ^ N T G (5')
Donde G, T, A y C representan a los nucleótidos guanina, timina, adenina y citosina, respectivamente; N indica un nucleótido cualquiera.
Desde entonces, y en miles de cepas bacterianas, se ha conseguido aislar enzimas de restricción que cortan secuencias específicas de ADN; hasta el momento se ha identificado más de 150 secuencias distintas de ADN reconocidas por las enzimas de restricción: estas secuencias se denominan sitios (o loci) de restricción.
Las enzimas en cuestión reconocen secuencias específicas compuestas por un número de bases que va desde 4 hasta 8. Una secuencia definida, del tipo de la T C G A reconocida por la enzima TaqI, de cuatro pares de bases, se repite en el genoma cada 256 pares de bases por término medio; mientras que una de seis pares de bases, del tipo de la G A A T T C reconocida por la enzima EcoRI, lo hace cada 4.096 pares de bases. Pero los loci de restricción no se distribuyen regularmente a lo largo de todo el genoma; existe otra causa, además de la estadística, que influye sobre la frecuencia con que se corta el ADN, y es la composición particular de bases que constituye una secuencia reconocida: por ejemplo, la enzima NotI reconoce una secuencia de 8 pares de bases en la que se encuentra una sucesión de citosina (C) y guanina (G) que raramente se produce en el genoma de los mamíferos, por lo que esta enzima corta muy pocas veces el ADN, produciendo fragmentos con una longitud de millón y medio de bases.
Algunas enzimas de restricción, como por ejemplo el Hind II, realizan el corte de la doble hélice de ADN por el centro de las secuencias que reconocen, de manera que las secuencias resultantes tienen los extremos romos (en inglés, blunt ends), y en ellos las bases continúan emparejadas con sus complementarias.
Otras enzimas de restricción, como el EcoRI, cortan la doble hélice de ADN formando una exfoliación que da como resultado la producción de colas de una sola hélice de ADN en los extremos de cada fragmento; estas colas de hélice única poseen bases que tienden a asociarse con otras bases complementarias y, por esta razón, se llaman extremos cohesivos o pegajosos (en inglés sticky ends). Para que pueda producirse el enlace entre bases complementarias de modo que los dos fragmentos cortados por el EcoRI se suelden entre sí, es necesario sin embargo que intervenga una enzima de otro tipo, llamada ADN ligasa, que cataliza la formación de nuevos enlaces fosfodiéster. De todo ello se deduce que dos moléculas de ADN de origen completamente distinto pueden unirse si antes han sido cortadas por la misma enzima de restricción que produce fragmentos de extremos cohesivos.
- ¿Cómo se aíslan los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restricción?
Hemos visto que, para estudiar el ADN de cualquier organismo, es preciso subdividirlo en fragmentos que resulten fácilmente manipulables, es decir, que puedan secuenciarse, clonarse y expresarse una vez insertos en células distintas de aquéllas que los han producido. Para todo ello es preciso "identificar" los fragmentos producidos por las enzimas de restricción. Supongamos que se quiere estudiar el genoma del virus SV40, que ataca a los simios. Para empezar, el virus se corta con una enzima de restricción elegida arbitrariamente y, a continuación, los fragmentos resultantes se separan mediante electroforesis en un gel de agar, según un proceso en el que, bajo la acción de un campo eléctrico, se produce la migración de las moléculas de ADN cargadas negativamente a través de un gel poroso de agar. Los fragmentos pueden tener distintas dimensiones, según el número de veces que las secuencias reconocidas por la enzima de restricción estén representadas en el genoma en cuestión. La velocidad de migración de las molécula de ADN a través de los poros del gel es función de la longitud de dichas moléculas. Tiñendo el gel con sustancias especiales que se unen al ADN, como el bromuro de etilo, puede observarse una serie de bandas; cada una de éstas corresponde a un determinado fragmento de restricción cuya dimensión puede establecerse comparándolo con moléculas de ADN de dimensión conocida. Además, al tratar un genoma con enzimas de restricción diferentes, se obtendrán necesariamente fragmentos de restricción diferentes. Por regla general, las enzimas de restricción más útiles resultan ser aquéllas cuyas secuencias de reconocimiento son escasas y que, en consecuencia, producen un menor número de fragmentos que son más fácilmente separables en el gel de agar. Volviendo al ejemplo anterior, el ADN genómico del virus SV40 es una molécula circular que, digerida por la enzima Hind II, produce 11 fragmentos específicos. La disposición en que estos 11 fragmentos aparecen ordenados en el genoma vírico puede determinarse procediendo a realizar digestiones sucesivas; la primera digestión, por ejemplo, rompe la molécula circular de ADN de manera que se produzca una molécula lineal y ésta, a continuación, resulta cortada en fragmentos cada vez más pequeños; el orden de sucesión de los fragmentos queda entonces determinado por el hecho de que los más pequeños están contenidos en los más grandes. Siguiendo este método se puede construir un mapa de restricción que localiza los sitios (loci) reconocidos por la enzima de restricción sobre el ADN circular del virus.
Este procedimiento se ha empleado para medir el genoma del virus SV40, que ha resultado estar compuesto por una secuencia de 5234 pares de bases.
- Los fragmentos de restricción sirven para secuenciar el ADN
Comprender lo que está escrito en un gen significa determinar la sucesión exacta de todas y cada una de las bases individuales que lo componen. Para conseguirlo es, obviamente, más sencillo identificar las bases que integran un pequeño fragmento que hacerlo para todas las que constituyen una larga molécula de ADN.
Existen dos métodos para determinar exactamente la posición de las bases individuales en un fragmento de ADN, es decir, para secuenciarlo: uno, llamado método de Sanger, se basa en la acción de las enzimas; el otro, denominado método de Maxam-Gilbert, está basado en un proceso de degradación química. El primero se fundamenta en el alargamiento de cadenas de ADN por medio de la ADN-polimerasa, enzima que normalmente es responsable de la duplicación del ADN. Se construyen nucleótidos trifosfatos sintéticos (ddNTP) que están faltos de 2 grupos -OH en las posiciones 2 y 3 de la molécula; tales moléculas se incorporan a la molécula de ADN en formación a través de sus grupos trifosfato en 5', pero no pueden unirse con los nucleótidos sucesivos porque les falta un grupo -OH en 3' para formar el enlace fosfodiéster, de modo que la reacción de alargamiento se bloquea. Si la molécula de ADN que ha de secuenciarse se hace intervenir en cuatro reacciones, en cada una de las cuales reacciona con un ddNTP diferente (ddATP, ddGTP, ddTTP y ddCTP), la síntesis del ADN que realiza la ADN-polimerasa en cada reacción se bloqueará al insertarse un ddNTP. Por ejemplo, en la reacción con ddGTP, la reacción de síntesis se bloquea cuando la ADN-polimerasa incorpora este didesoxinucleótido porque encuentra, sobre la cadena, su base complementaria que es la citosina. Si los fragmentos complementarios producidos por esta reacción tienen 6, 9 y 13 bases de longitud, respectivamente, ello significa que los nucleótidos G están en las posiciones 6, 9 y 13 porque han sido los últimos en resultar incorporados en la síntesis de los tres fragmentos. Después, los fragmentos producidos por las cuatro reacciones se separan según su longitud en un gel de acrilamida, y de su perfil se obtiene la secuencia de ADN.
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